基于siRNA/miRNA的高通量篩選

我們的策略是直接在功能上研究，通過(guò)siRNA沉默候選基因篩選得到功能基因。siRNA和藥物聯(lián)合使用可以篩選到能夠起增敏作用的靶基因。這些數(shù)據(jù)為靶向治療和聯(lián)合用藥提供了重要依據(jù)?；谌蚪MsiRNA文庫(kù)的高通量篩選，可平行分析成千上萬(wàn)條基因功能，大大加快研究進(jìn)程，從而能迅速、全面地鑒定出細(xì)胞過(guò)程或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的相關(guān)基因，以及疾病相關(guān)的藥物靶基因，保證研究成果更為系統(tǒng)和新穎。

技術(shù)介紹

基于多孔板和液體工作站的篩選方法

預(yù)先將siRNA文庫(kù)里各條siRNA分別與轉(zhuǎn)染試劑混合，轉(zhuǎn)移到384或96微孔板中，然后將培養(yǎng)好的細(xì)胞接種到微孔板里，細(xì)胞被轉(zhuǎn)染siRNA。經(jīng)過(guò)48-72小時(shí)的培養(yǎng)，蛋白表達(dá)水平被沉默后，通過(guò)高通量的微孔板讀數(shù)儀或高內(nèi)涵掃描顯微鏡讀出孔板里的細(xì)胞信號(hào)。若這些細(xì)胞信號(hào)與參照組相比發(fā)生了顯著變化，則認(rèn)為相應(yīng)的siRNA與研究的細(xì)胞過(guò)程相關(guān)，從而鑒定出相關(guān)的候選基因

自組裝細(xì)胞芯片篩選技術(shù)

除了傳統(tǒng)的孔板篩選服務(wù)外，篩選平臺(tái)針對(duì)大規(guī)模篩選需求，成功開(kāi)發(fā)出先進(jìn)的自組裝細(xì)胞芯片技術(shù)（Self-assembled Cell Microarray，SAM cell）。在玻璃蓋玻片上，利用微加工技術(shù)（micro-fabrication）使細(xì)胞自組裝形成細(xì)胞小島微陣列，高集成化的微陣列極大地提高了篩選通量。同時(shí)采用反向轉(zhuǎn)染技術(shù)，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)染過(guò)程，延長(zhǎng)了保存時(shí)間，這將大大減少篩選中使用的siRNA和相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑。SAM cell技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用于siRNA文庫(kù)、質(zhì)粒文庫(kù)及化合物文庫(kù)的高通量篩選。

SAM cell技術(shù)流程

在芯片上點(diǎn)印siRNA、質(zhì)?；蛘呋衔?，接種細(xì)胞后，細(xì)胞在自組裝形成細(xì)胞島點(diǎn)陣，同時(shí)相應(yīng)位置上點(diǎn)印的內(nèi)容自動(dòng)轉(zhuǎn)染到對(duì)應(yīng)的細(xì)胞小島，最后通過(guò)高內(nèi)涵圖像掃描系統(tǒng)成像，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞島間無(wú)交叉污染

在25x25mm的蓋玻片上，細(xì)胞在自組裝形成點(diǎn)陣的同時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)GFP的質(zhì)粒，細(xì)胞小島間隔形成熒光點(diǎn)陣，而相鄰的細(xì)胞小島（沒(méi)有轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒）則沒(méi)有熒光信號(hào)。

成功案例

1、已知藥物功能篩選其增敏靶點(diǎn)

篩選策略：

1.   明確該藥物功能，明確該藥物藥效的dose curve。

2.   選取與此項(xiàng)功能相關(guān)的信號(hào)通路，設(shè)計(jì)合成siRNA，建立文庫(kù)。每個(gè)基因設(shè)計(jì)合成3條siRNA。如涉及面廣，可直接使用全基因組siRNA文庫(kù)。如果小規(guī)模試篩，可以考慮選取激酶siRNA文庫(kù)，700個(gè)基因。

3.   開(kāi)展篩選工作：低劑量的藥物與siRNA文庫(kù)共篩，以高劑量藥物作用組為正對(duì)照，鑒定出增敏效果的siRNA。

4.   根據(jù)增敏結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)分析，推斷出藥物增敏靶點(diǎn)以及藥物作用的信號(hào)通路，甚至是藥物直接作用的靶基因。

2、已知功能基因篩選調(diào)控該基因的miRNA

篩選策略：

1.   人類(lèi)miRNA mimics文庫(kù)構(gòu)建：約1100條，或由客戶定制。

2.   熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建：根據(jù)目的基因3’UTR的長(zhǎng)度而定，一般每300-800bp構(gòu)建一個(gè)載體。

3.   篩選：建議使用Hela細(xì)胞系，或目標(biāo)細(xì)胞系，96孔板篩選。

每個(gè)報(bào)告基因載體都要將miRNA文庫(kù)篩選一遍。

每孔共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒，miRNA mimics，內(nèi)參renilla質(zhì)粒。以不干擾任何基因的siRNA NC 為陰性參照。

48小時(shí)后裂解細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀測(cè)量luciferase活性?；钚越档偷臑殛?yáng)性miRNA。

現(xiàn)貨孔板文庫(kù)信息

成品文庫(kù)信息：

1.  人類(lèi)全基因組siRNA文庫(kù)：約21000 個(gè)基因，每個(gè)基因?qū)?yīng)3條siRNA，分別為A，B，C三個(gè)亞庫(kù)。

siRNA序列設(shè)計(jì)參考美國(guó)著名siRNA生產(chǎn)商，3'末端采用特殊修飾。

分裝在384孔板中，規(guī)格為每孔5-8pmol，氬氣保護(hù)，鋁膜封裝，-80度儲(chǔ)存。

報(bào)價(jià)：總價(jià)25W，單買(mǎi)一個(gè)亞庫(kù)10W。

貨期：1周。

2.   人類(lèi)激酶siRNA文庫(kù)：約700個(gè)基因，每個(gè)基因?qū)?yīng)3條siRNA，分別為A，B，C三個(gè)亞庫(kù)。

siRNA序列設(shè)計(jì)參考美國(guó)著名siRNA生產(chǎn)商，3'末端采用特殊修飾。

分裝在96孔板中，規(guī)格為每孔20-25pmol，氬氣保護(hù)，鋁膜封裝，-80度儲(chǔ)存。

報(bào)價(jià)：總價(jià)8W，單買(mǎi)一個(gè)亞庫(kù)3W。

貨期：2-3周。

3.   人類(lèi)磷酸化酶基因siRNA文庫(kù)：約300 個(gè)基因，每個(gè)基因?qū)?yīng)3條siRNA，分別為A，B，C三個(gè)亞庫(kù)。

siRNA序列設(shè)計(jì)參考美國(guó)著名siRNA生產(chǎn)商，3'末端采用特殊修飾。

分裝在96孔板中，規(guī)格為每孔20-25pmol，氬氣保護(hù)，鋁膜封裝，-80度儲(chǔ)存。

報(bào)價(jià)：總價(jià)4W，單買(mǎi)一個(gè)亞庫(kù)1.5W。

貨期：1-2周。

4.   人類(lèi)miRNA模擬體文庫(kù)：約1100 個(gè)miRNA

序列參考miRbase, 3'末端采用特殊修飾。

分裝在96孔板中，規(guī)格為每孔20-25pmol，氬氣保護(hù)，鋁膜封裝，-80度儲(chǔ)存。

報(bào)價(jià)：6W。

貨期：2-3周。

5.   FDA認(rèn)證化合物文庫(kù)：約1000個(gè)化合物。

DMSO溶解，分裝在96孔板中， -80度儲(chǔ)存。

詢價(jià)。

參考文獻(xiàn)：

1.  Whitehurst A W ,Bodemann B O , CardenasJ , et al. Synthetic lethal screen identification of chemosensitizer loci incancer cells[J]. NATURE, 2007, 446(7137):815-819.

2.  Junyu Yang, Milton E. Brown, HanshuoZhang, et al. High-throughput screening identifies microRNAs that target Nox2and improve function after acute myocardial infarction[J].Am J Physiol HeartCirc Physiol, 2017,312: H1002–H1012.